一文读懂｜CDE综述：间充质细胞治疗药物质量控制及审评中常见问题分析

2025年，国际细胞治疗学会（ISCT）正式发布新标准，将沿用30余年的“间充质干细胞”更名为 “间充质基质细胞”。

综述中指出，如果企业仍希望以“干细胞”名义申报先进治疗药品，必须额外提供自我更新、多向分化等研究证明其“干性”。新标准同时明确：CD73、CD90、CD105阳性率≥95%，CD14、CD19等造血/免疫标志物阳性率≤2%，并排除了体外三向分化检测与标准贴壁生长要求，强调注明组织来源、加强效力等关键质量属性评估，终结了 30 余年细胞身份争议。

1. 审评关注点：

*供体筛查：必须覆盖HIV-1/2、HBV、HCV、梅毒螺旋体；富含白细胞的供体还需检测HTLV-1/2、CMV等。需设置“最短且可靠”的检测窗口期，推荐采用监管机构批准的试剂盒。

*伦理合规：提供完整的知情同意与伦理审查文件，供体性别、年龄、病史等可追溯。

*细胞库建设：MSC库构建需要结合其多组织来源异质性及低免疫原性特性，采用主细胞库（MCB）与工作细胞库（WCB）二级体系。其中主细胞库由严格筛选的初始细胞( 如骨髓、脐带或脂肪来源原代 MSC) 扩增建立，需要全面检测细胞鉴别、活力、纯度、微生物污染及遗传稳定性等指标。

限传代次需有功能与稳定性数据支持：主细胞库传代通常不超过3～5代(P3 ～P5)，工作细胞库由其传代不超过 5 代。不同来源差异明确——脐带或胎盘来源MSC在P5代内可维持高效活性；脂肪来源MSC至P8代后衰老加速（增殖下降、β-半乳糖苷酶阳性细胞增多），不建议用于系统性治疗。

*iMSC额外要求：iPSC需检测多能性（Oct4等标志物阳性率≥95%），并经免疫缺陷小鼠畸胎瘤实验验证。iMSC纯度需≥95%，遗传稳定性监测除常规核型分析外，须加做全基因组测序与全外显子测序，要求变异频率低于阈值。未分化iPSC及异常细胞残留量需验证。

2.审评常见问题：

（1）供体筛查项目不全，未考虑窗口期风险，信息追溯缺失。

（2）细胞库纯度缺乏流式验证，工作细胞库与主细胞库质量差异大时未分析操作偏差。

（3）限传代次仅凭经验，缺乏该细胞系传代稳定性与功能保留性验证数据。

（4）iMSC遗传稳定性仅做核型分析，未做测序，难排除致瘤风险。

（5）iPSC多能性验证仅靠标志物表达，未做畸胎瘤实验或无三胚层结构。

（6）iPSC残留检测未验证最低检测限，非预期细胞无特异性检测法。

1. 审评关注点：

*培养工艺：从传统二维培养转向无血清、成分明确的培养基及三维培养系统（微载体、生物反应器），是提升产量和一致性的趋势。含血清培养基成分复杂、批次差异大，可能引入病原体和异种蛋白。

*关键参数：温度、pH、溶氧等需严格监控并多批次验证。iMSC重编程阶段需使用成分精准调控的特定培养基，促体细胞向 iPSC高效转变，避免增殖或分化异常。iPSC向iMSC分化阶段，须按分化路径优化培养基。全程监测细胞群组成、纯度、标志物表达等关键指标。

*过程控制：贯彻“质量源于设计”（QbD）理念，建立完善的过程分析技术（PAT）体系。中间控制点（IPC）包括：分离后检测活率、纯度及初始表型；传代监测表面标志物与核型稳定性；收获前验证活力、无菌及功能活性。IPC结果超范围应立即停产分析。

*收获、冻存、制剂：贴壁细胞常用胰酶消化，优化离心转速与时间；制剂冻存需开展冻存及复苏工艺验证；制剂应结合剂型(如注射液、冻干粉)和给药途径(如静脉、局部注射) 优化配方与工艺,确保匹配临床需求。iMSC收获须确保细胞活力≥95%，冻存后检测关键基因表达变化。

2.审评常见问题：

（1）含血清培养基风险高，未明确内毒素等筛选指标及批次影响，缺乏伦理说明，增加病原体风险。

（2）关键参数（温度、pH、溶氧）无动态记录及预案，未按密度调整溶氧。

（3）工艺参数验证仅单次确认，未检测3批验证重复性。

（4）重编程不规范：表观遗传调控试剂（如丙戊酸）浓度数据不足，未明确时序与效率，未去除异常细胞。

（5）监测体系不完善：无分阶段监控，中期未检测部分重编程细胞。

（6）收获方法替代缺乏依据，离心参数未多批验证，洗涤后培养基成分残留。

（7）冻存程序降温参数不明，复苏后仅检测活力，未验证功能性指标。

（8）制剂未按剂型、给药途径优化配方，内包材相容性研究缺失。

（9）PAT体系不系统：仅监控温度、pH，缺少换液频率、消化时长等工艺参数记录。

（10）IPC设置不合理，结果超限无实操流程，偏差后缺乏有效分析。

1.审评关注点：

*细胞鉴别：多维度验证。严控形态异常比例；表面标志物（CD73/CD90/CD105≥95%，CD14/CD19≤2%）；分化潜能（成脂油红O染色、成骨茜素红染色、成软骨阿尔新蓝染色）；STR/DNA指纹图谱（确保生产用细胞与原始细胞库遗传一致，排除交叉污染）；染色体核型分析至少20个分裂相，传代多的细胞加做FISH。

*活率与增殖：活细胞数及活率（台盼蓝拒染法、CCK-8法）；细胞周期（G0/G1期、S期比例）；群体倍增时间（PDT）通过生长曲线监测，批间一致；PDT显著延长时结合β-半乳糖苷酶染色评估衰老；端粒酶活性优选q-PCR-TRAP法。

*微生物与安全：细菌、真菌、支原体外，外源病毒检测须覆盖HTLV-1/2、HIV等，结合供体特性（胎盘来源查人细小病毒B19）。检测方法采用“细胞培养法+PCR+新一代高通量测序（NGS）”筛查已知与未知病毒，须验证低丰度检出能力。致瘤性评估通过体外软琼脂实验和体内小鼠接种实验，iMSC需延长观察周期。

*生物学效力：须紧密关联临床作用机制。免疫调节类产品采用 “漏斗式+阶梯式”评估：先检测上清中IL-10、TGF-β等抑制因子分泌量；再经体外共培养检测对CD4+T细胞增殖的抑制率；最后在类器官或动物模型中验证炎症缓解效果，确保体外效力与体内疗效关联。组织修复类监测软骨厚度、Ⅱ型胶原蛋白表达、VEGF分泌等；归巢能力通过Transwell实验测SDF-1α趋化率或动物模型荧光标记观察24h内靶器官迁移效率。

*纯度与杂质：细胞纯度上，流式细胞术严控CD45+残余血细胞与CD90+CD105-成纤维细胞污染。工艺相关杂质（重组胰酶、牛血清白蛋白等）设定残留限值；<10μm微载体碎片靠显微计数管控。产品相关杂质须控制死亡细胞比例、<5μm细胞碎片及宿主细胞DNA残留（须控制片段长度），规避炎症与遗传风险。

*放行标准：原液须检测STR分型、核型分析、活率、数量、细胞周期、群体倍增时间、纯度、微生物、内毒素、致瘤性、生物学效力、外源因子、杂质等全项目。制剂须检测细胞鉴别、活率、数量、无菌、内毒素、支原体、渗透压、pH值、生物学效力、辅料残留等。

*iMSC额外质控：重编程因子（Oct4、Sox2等）残留用数字PCR等高灵敏度方法严控含量；强化遗传稳定性（核型+全基因组测序+甲基化分析，控制变异系数）；升级致瘤性评估（体外增测细胞增殖潜能，体内延长免疫缺陷小鼠观察时间）；全面验证功能等效性（与天然MSC头对头比较免疫调节、归巢、分化能力）；单独验证重编程方法安全性（检测病毒载体残留与整合风险）。

2.审评常见问题：

（1）检出与重复性差：比对少、低丰度检出弱、功能学重复性差、批间变异超标。

（2）细胞鉴别仅测表面标志物，缺少STR分型防污染，核型分析分裂象不足。

（3）微生物快速检验验证仅1~2批，未覆盖多污染场景；支原体PCR检测缺少培养法复核。

（4）生物学效力：体外指标与体内疗效无对应，未覆盖细胞比例活性差异，未按适应症优化检测。

（5）杂质控制：工艺杂质限值无依据，宿主细胞DNA未控制片段长度，未评估死细胞及碎片安全性。

（6）质量标准：鉴别标准单一、无动态阈值，内毒素限值未依规设定，纯度未考虑组织来源差异。

（7）iMSC特有风险：未验证与天然MSC功能一致性，病毒载体残留及整合风险未测，分化标志物质控体系缺失。

（8）放行检测：原液缺少PDT与细胞周期检测，制剂缺少渗透压等指标，未测重组胰酶、重编程载体碎片等杂质。

• P0~P5扩增倍数稳定在10.0~12.75倍，P3代最高（12.75倍），与综述所述“早期代次功能最优”吻合。

• 支持传代至P20无细胞老化，为生产窗口延长提供依据，有效解决“限传代次依据不足”问题。

• 端粒酶活性：6.77TPG（正常低水平，阳性对照3626.6）。

• 核型分析：G显带46，XX；分析100个分裂相，异常数均在药典参考值内（远超综述要求的20个分裂相）。

• 软琼脂克隆形成实验：无克隆形成（Hela阳性对照组大量克隆）。

• 已验证适用于iMSC扩增与功能维持，无血清体系降低重编程因子残留干扰。

CDE综述反复强调一个核心观点：间充质细胞治疗药物的质量可控性，是其临床转化的生命线。 从供体筛查到限传代次，从表面标志物到致瘤性评估，每一项审评要求背后，都是对细胞药物安全性、有效性与一致性的严苛拷问。

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本文基于《中国新药杂志》2025年第34卷第24期《间充质细胞治疗药物质量控制及审评中常见问题分析》整理编写。